1.本站不该用户上传的文档完整性，不预览、不比对内容而直接下载产生的问题本站不予受理。 ://../ /作物学报, :? ; ? : . . : . / . . . .小麦穗发芽抗性相关 基因启动子的分离及功能验证孙永伟 聂丽娜 马有志 徐兆师 夏兰琴中国农业科学院作物科学研究所,摘 要:成熟期穗发芽严重影响小麦产量和品质。 是调节胚发育,促进胚成熟和休眠的重要因子,对小麦种子休眠和穗发芽抗性具有重要作用。本研究分离了普通小麦 基因组 基因的启动子,生物信息学预测结果表明,其含有 个脱落酸响应元件 、 个 和 个干旱响应元件、 个赤霉素响应元件 、 个水杨酸响应元件? 、 个茉莉酸甲酯响应元件 ?、 个 一 和 个胚乳表达元件。采用,端缺失的方法,构建了系列含 启动子不同区段融合报告基因的瞬时表达载体和植物表达载体。通过基因枪小麦愈伤组织,瞬时表达结果显示, 启动子在无的情况下不能启动 基因表达,在低温、、、和 后可以启动基因表达,表现表达特性,且其表达强度随启动子缺失片段长度变短而减弱。利用 方法成功构建了 个启动子各缺失片段类型的植物表达载体,并通过农杆菌介导四倍体小麦,获得转基因植株。该启动子可有效启动基因在转基因植株的花药、糊粉层、穗轴及根中表达,其他组织中没有表达。当启动子片段大于 时,外源可启动子启动基因在转基因植株茎节中的表达。关键词:穗发芽; 启动子;功能分析;转基因小麦一? ,. , ? ,. , ? , , ,: / ,.? 。 ? . ../, , , ,? , ? 一 . ? . . ?. ?,, .,. .? ? .. . , . , .: ? ;; ;的穗发芽抗性机制也可能不同。在影响小麦穗发小麦穗发芽 ?,是指收获前籽粒在麦穗上发芽的现象,影响小麦产量和品 芽的众多基因中, 是调节胚发育,促进胚成熟和质,是世界性的自然灾害”。小麦穗发芽与多种因素休眠的主要调节因子,该基因位于小麦第 同有关,是由多基因控制的复杂性状,而且不同品种 源群染色体的长臂上引。以成熟期的小麦胚为材料,本研究由国家重点基础研究发展计计划项目 资助。通讯作者:夏兰琴, : .. . . :? 第一作者联系方式: ? : . , : ? 收稿日期: ? ; 接受日期 :? ;网络出版日期:?:://. . / / / .. . ..作 物 学 报 第 卷分析 的本结构,发现每个同源基因都会产 的特性和功能,为进一步解析小麦 基因介导的生一套大小不同的本,原因是后前体穗发芽抗性机制奠定了基础。 发生了选择性的剪接,导致无法编码全长材料与方法 蛋白,从而表现对穗发芽。根据 基因. 材料序列中跨越 个内含子的 区段设计性引物,对 个 人 合成六倍体小麦进行 , 采用小麦品种万县白麦进行 启动子分离,兰考 成熟胚愈伤进行瞬时表达研究,四倍发现这 个合成小麦之间存在不同的剪切模式,进一体小麦用于农杆菌。植物表达载体步证明 在时不同的剪切方式是导致品种间穗发芽抗性差异的重要因素之一 。然而, 由本实验室保存。?和 等研究了强休眠品种和非休眠品种 成熟胚中 基因的表达,发现在购自公司。农杆菌菌株,中 的表达量大于在 中。燕麦 只形成和 ? 载体由英罔的一 博士提供。种本,把燕麦 转入小麦时,转基因小麦穗发芽程度明显降低】。小麦的 个 同 .启动子的分离及功能预测源基因中,位于 染色体上的 对穗发芽抗性 以穗发芽抗性品种万县白麦 基因序列为起关键作用,并且存在广泛的多态性 。等 模板在中 ,获得含有 ,曰基因及其在小麦 染色体上发现了 个与穗发芽抗性相关的上游序列的序 登录号为 ,, 的新型等位变异 和 ,由 编 并以此序列为模板设计引物 . 和 ? 表 ,码区第 内含子中反转座子的插入和转座子的缺失分离小麦 基因上游 的启动子。引起,尽管存在错误剪切现象,但 各等位基利用启动子顺式作用元件在线分析网站因正常本的表达量与种子的 性和://.. . . / / . 和穗发芽抗性呈正相关。对中国和欧洲小麦品种 ://. . . . / / / 对 』启动子所含功能元件变异类型检测,现 种基因型,分别是、生物信息学预测。、 、和。 等. 小麦 启动子瞬时表达和植物表达载体构建同样发现具有较高休眠性的品种对 性要. . 瞬时表达载体构建 根据生物信息学预测高于非休眠性品种, 染色体上表达起主导结果,采用缺失的方法构建瞬时表达载体,上游作用,并与种子休眠性呈正相关;处理后胚中引物分别为 ? 、 一 、 一 、含量明显提高,其编码蛋白可和 一下游引物 ? 表,扩增长度分以激活基因表达和 一淀粉酶的活性,从而别为 、 、、和 的启动子缺影响种子休眠性。但小麦 启动子在穗发芽抗性失片段。将分离的缺失片段用 和 酶中的作用和其所介导的 应答机制目前尚未见切后,与相同酶切后的 载体片段连接,用于报道。构建报告基因植物表达载体。以 的启玉米 启动子和拟南芥的同源基因启动动子为例,其瞬时表达载体构建方法如图 。子均为组织性启动子,主要在胚中表达。但当. . 植物表达载体的构建 采用 方法受到和干旱、高盐等逆境时,其表达程度构建农杆菌介导的植物表达载体,其方法如冈 以均有提高,并在茎等组织中表现出不同量的表达, 的启动子为例。首先以瞬时表达载体为模呈现出非组织性特征『 ”。深入研究小麦板利用扩增方法获得启动子融合基因及启动子,对了解不同逆境条件下 的表达调控及终止子的表达盒,上游引物分别为 ? 、 一 、其在小麦穗发芽抗性中的作用具有重要的意义,同一 、 一 、 一 和一 ,下游引时也可为进一步利用此启动子进行抗逆基因 程操物为 ? 表。参照 作提供依据。本研究克隆了小麦 基因组 启动 说明书 ,将纯化子,并构建了系列缺失载体。通过瞬时表达和在转基因小麦中的稳定表达,明确了启动子及所含元件 产物分别与 载体按照摩尔比 : 混合,室第 期 孙永伟等:小麦穗发芽抗性相关 基因启动子的分离及功能验证 的平板上筛选,挑取单菌落进行鉴定,阳性克隆提取质粒后测序正确的即为构建成功的表达载体。. 小麦成熟胚愈伤组织的瞬时表达及逆境将培养周的兰考小麦成熟胚愈伤组织转移到高渗培养基培养基添加 . 甘露醇和 .山梨醇中央区域,处理 ~ 后采用基因枪方法轰击小麦愈伤组织,将后的小麦愈伤组织转移到普通 培养基上,或分别含有~、 % 、 ~ 、和的培养基上。将接种在培养基上的转基因愈伤组织置 ℃冰箱中,其他愈伤组织置℃培养箱内,处理后恢复图 瞬时表达载体构建过程. 培养 。. 农杆菌介导方法四倍体小麦温下连接 ,将连接产物热激大肠杆菌将表达载体分别与辅助载体按 : 比 后涂布在含有 的平板上例均匀混合后,采用电击法转入农杆菌,参照筛选,挑取单菌落进行 鉴定,阳性克隆提取质等 的方法四倍体小麦 。粒后测序正确的即为构建成功的 载体。参照. 转基因小麦的检测 说 明书采用 的方法提取转基因小麦基因组,,在 . 管中加入质粒并利用基因性引物 / 检测阳性 , ? 质粒,植株表 ,预期产物长 ,扩增程序为, . , ,预变性 ;变性 , ℃退火 , ℃延短暂混匀后 ℃孵育 ,待反应完全后加入蛋白酶 于 ℃终止反应。取 反应液 伸, 个循环; ℃延伸 ,扩增产物经%琼脂糖凝胶电泳后检测条带。热激大肠杆菌 后涂布在含有 作 物 学 报 第 卷 ::■??■■: , 图 植物表达载体构建过程 . . 转基因小麦组织器官外源方法 有关的顺式作用元件表 和图 。随机挑选 株 代转基因株系材料,将各组织 . 启动子缺失系列驱动 在小麦愈伤组织分别置于含有的 液体培养基中, 中的表达后进行组织化学染色。为了分析 启动子不同区段的功能,构建了. 组织化学染色方法 系列缺失片段类型瞬时表达载体。各种缺失类型所?染色反应液成分为~ 、 含元件见图 。 ::的愈伤组织在.%一、 %甲醇和 .?不受逆境时,没有启动基因的表达。低温、. 。待测组织与该反应液在 ℃保温 ~ 后,用 和后,愈伤组织中表达明显增%乙醇将叶片等绿色组织脱色,最后用电镜拍照。 加。其中,低温 以上启动子片段驱动 表达增强;在处理条件下, 以上启结果与分析动子表达明显增强:而 处理则只能促进 ::、 ::和 ::. 启动子的分离及所含功能元件预测 愈伤组织中的表达。随着缺失片段长利用生物信息学结合的方法从穗发芽抗性度的增加,不同条件下的愈伤组织颜色逐渐变品种万县白麦中克隆了 的 基因组 启淡。和处理未明显表达图 。动子。该启动子无典型的 ?和 ,含. 转基因小麦中的 启动子表达特性分析有 个脱落酸响应元件 、 个 和 个 检测获得个转启动子各缺失片段类型 干旱响应元件、 个赤霉素响应元件 、个水杨酸响应元件 . 、 个茉莉酸甲酯响应元 基因阳性株系图 ,其中:: 株,件 ?、 个. 和 个胚乳 :: 株, :: 株, ::表达元件以及其他一些与光、热、离子等应答 株,:: 株,:: 第 期 孙永伟等:小麦穗发芽抗性相关 基因启动子的分离及功能验证△ 令一◆ ▲ . ?? ●图曰启动子所含顺式作用元件结构图 . :干旱响应元件;:干旱响应元件;一 :胚乳表达元件; :胚乳表达元件; :赤霉素响应元件;? :水杨酸响应元件; ? :茉莉酸甲酯响应元件; ? :逆境相关响应元件;? :激素响应元件; :脱落酸响应元件。 : ?;: ? ;: ; : ; : ? ;? : ? ;? : ? ? ; ? :? ;? : ? ; :.株。选取 代不同生长时期的各组织器官进行小麦以启动基因在花药、穗轴、根中表达,同时表基因启动子组织性表达分析表 和图 , 现出元件性。例如在糊粉层中,只有 的结果表明, 种 基因启动子缺失片段类型均可启动子片段不能驱动 基因表达,当启动子大作 物 学 报 第 卷厶 ◇一 ▲ ? . . ●图启动子缺失系列融合载体示意图.。 :: 茹 ” 锵 辩:: 肇 。嗡 ●舞蓦舔:: 裹 ≤ 耩 霸 一 :: ¨搬 一 爱,?:: 套 。图 不同处理条件下小麦成熟胚愈伤组织 启动子 端连续片段表达载体的组织染色结果. 、、 和 的处理浓度分别为~, %, 和 ~。一。 ; %. ~ .~.一 一讨论基因在种子的成熟、休眠及发芽过程中起 关键作用 。们。目前,已经相继分离了拟南芥及玉米、豌豆的 启动子,并进行了功能分析 。,”】,图代转基因小麦的检测其中对玉米 和拟南芥的启动子的研究最为.深入,它们均属于组织性启动子并具有表:; :; : ;和 :阳性植株:~ :非转基因植株。达特性 。引。我们在前期研究中发现,位于小麦 :; :; : 一; : 染色体上的 直接影响穗发芽抗性,不同 』 :?.等位基因的表达量与穗发芽抗性直接相关,而且所介导的 性不同】。 等?也指出,于 时能有效驱动基因表达;但是在颖壳中大于 的启动子不能启动基因表达,而 是种子休眠过程中起主导作用的重要调小于的启动子片段可以启动基因表达。节因子之一,参与调控种子成熟过程中休眠相关基另外,在茎和叶中, 种表达载体均不能启动表 因的表达。然而,抗、感穗发芽品种中是否存在调达,然而当有外源存在时,在茎节中表现出诱控序列的差异以及小麦 如何实现调控,目导表达特性,当启动子片段大于 时,表前尚不清楚。达结果很明显。但在叶中,在有或无外源处理为了解 介导的小麦穗发芽抗性机制,我们条件下均无基因表达。从抗、感穗发芽品种分离了 基因组 启动子,发第 期 孙永伟等:小麦穗发芽抗性相关 基因启动子的分离及功能验证表 不同启动子缺失系动在转基因小麦不同组织中的表达模式 。 一:无外源; :添加 外源; :表达;一:未表达。 一: ; :一 ; : ;一: 图 在转基因小麦中的表达 . :种子中染色; :茎节中后染色; :未处理茎节染色; :穗轴和颖壳中染色; :花药中染色。: ; :; : ; :.现抗、感穗发芽小麦的 调控区序列一致。抗、 小麦种子发育、成熟和萌发过程中,内源激素感穗发芽小麦品种中的 基因组 编码区序列分 和 对 』的表达起重要的调控作用。在种子发析表明,在第 内含子中反转座子的插入和转座子 育过程中,的主要作用是促进胚发育,水的缺失,导致了不同 等位基因的表达差异,从 解酶主要是 【一淀粉酶的产生,萌发;在未成而最终表现为穗发芽抗性不同。为进一步了解熟种子中则启动休眠相关基因表达,导致并保持成调控及其对的应答机制,我们利用万县白 熟种子的休眠『引。研究发现,小麦种子的休眠性与麦中分离出的 基因组 启动子,通过瞬时表达 种子中水平无关,而与胚对的性相和在转基因小麦中的稳定表达进行了缺失功能分 关 。相反, 能够促进胚乳中储藏物代谢,可以析。瞬时表达结果表明,该启动子在没有逆境 解除种子休眠,从而诱发种子萌发叫。 和 的情况下,不能启动下游基因的表达;在低温、 在种子萌发过程中存在互作,可以直接干预和 等条件下,可以启动下游基因表达。因此, 的合成而萌发。可以推测, 个响应元件可以推断 启动子为型启动子。但 启动 的存在,可以在种子成熟过程中,对内源激子的 个缺失表达载体:.、 :: 素作出应答,启动 基因的高效表达,从而 和 ::的愈伤组织在低温、 激活下游等基因的表达,并对启动子区域含有 和后 表达明显增强 图 ,与 元件和元件的相关基因,如 基因、【一相比,和 的效果并不明显,说 淀粉酶和迟熟 【一淀粉酶等起重要调控作用,进而促明该启动子只对低温、和作出应答,以 进种子成熟和对等的应答,同时, , 和 等对信号传导起负调控基因的表达 。 处理后的效果最为明显,推测可能与该启动子片段含有 个 元件有关。 有趣的是, 启动子中还含有 个响应元件本研究分离的 启动子含有 个响应元 , 处理后,含有 的启动子片段导致件 和 个 响应元件 表 ,说明在 表达明显增强。这表明在种子萌发过程中,随作 物 学 报 第 卷着种子内源 含量的增加, 和可通过互作当有外源存在的情况下,除 的启动子外,和调控相关基因的表达,控制种子休眠、萌发和对 其他启动子片段均可基因在转基因小麦茎逆境的适应性。 节中表达。根据启动子功能元件预测结果,启对转基因小麦研究结果表明,本研究分离的 动子只存在 个 应答元件图 , 等】 启动子的活性表现为组织性,在种 研究表明,一个 并不能有效对的作子糊粉层、花药、穗轴和营养器官根中均不同程度 出应答,必须存在另外一个 或 核心序列才地表达,在其他组织没有表达。值得指出的是,本研 能发挥作用。究结果与 等阻 对拟南芥启动子研究结果一结论致,在转基因小麦叶片中,在有或无外源从穗发芽抗性品种万县白麦中首次克隆了长度条件下,均未观察到基因的表达。但是所有启为的 基因组 启动子,该启动子含有动子片段均能驱动基因在根中表达表 ,推测 、 及 等顺式作用元件,为型与 基因的 有关。在 不存在情况启动子,在低温、、 下可有效启动下游下,拟南芥启动子也表现根部表达性『 。另基因表达,但随着启动子片段长度变短,其启动下外,本研究还发现全长的 启动子只能游基因表达的效率逐渐降低。该启动子在转基因小驱动在糊粉层中表达,并没有像预期那样在胚麦中表现组织性,在没有的情况下,可以中表达。推测原因可能是该启动子长度不够,启动基因在糊粉层、花药、穗轴和根中表达,外区段的启动子中并不包含胚性元件,或者由源后可在茎节中表达。因此 曰启动子于 的原因导致 启动子表达组织性为组织性启动子,但在低温、、 下发生改变。 等 发现将胚表达启动子的可有效启动下游基因表达。置换糊粉层表达基因的 ,可导致下游基因在胚和糊粉层中同时表达。另外,与种子萌发相关的.淀粉酶和迟熟【一淀粉酶基因大多数在【 世和, ?长生, ? 萍,糊粉层表达, 启动子在糊粉层的表达,在一孙果忠.小麦穗定程度上解释了作为因子,可通过对【一淀发芽研究. :粉酶和迟熟 【.淀粉酶基因的调控,种子萌发,, . 【 ? 何震天, ? , 韩月澎. 促进休眠,最终表现穗发芽抗性。 本研究还发现,不同调控元件的存在的确导致 . 种子,, :启动子的组织性。例如,在种子中基 因主要在糊粉层中表达,然而 的启动子却不【, , , , , .能启动基因表达,当启动子片段大于 时,. , , :则能启动基因在糊粉层中表达表 ,因此,可以确定在 ~ 之间有糊粉层性元件或种【 , 子性元件存在,生物信息学预测结果表明在?., , :?之间有 个胚乳表达元件,分别是【 ,.. 和 ,推测在糊粉层中的表达可能与?. , ,这 个元件相关;在颖壳中, ::、:: :和 ::载体有表达,而当启动子片【 , . 段大于时,基因并没有表达表 ,生 如 .物信息学预测发现,在 至 区间,只 . :?存在对 应答元件 和甲基茉莉酸应答元件【 】 , , , ,,,,是否有负调节因子或者其他组织特 ,.异性元件导致该情况的发生,尚需进一步研究。一 ? . , , :在转基因小麦中 启动子也表现出特性, 推荐：
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